普健生物(武汉)科技有限公司(AtaGenix)

112018-07

5个要点助您告别蛋白包涵体

大肠杆菌表达系统因其代谢途径和基因表达调控机制研究透彻、培养周期短、目标基因表达水平高且遗传背景清楚,是目前应用最广泛的表达系统。美中不足的是用其表达蛋白时经常出现包涵体使蛋白不具生物活性。因此如何实现蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达就显得至关重要。

AtaGenix(大肠杆菌可溶性蛋白表达成功率达到95%)认为可以从以下五个方面进行考虑:

1 信号肽

信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链5-30 AAs),主要作用是促进蛋白折叠成特定空间结构,同时决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区。对于大多数大肠杆菌胞内表达来说,信号肽基本丧失了它的功能,同时信号肽的疏水性会造成蛋白在大肠杆菌内表达成不可溶状态,所以在大肠杆菌中表达蛋白通常要去掉信号肽,以促进蛋白的可溶性表达。


2 密码子优化

带有相应密码子的tRNA将氨基酸引导到mRNA上进行蛋白质的翻译合成。在原核生物中,由不同tRNA含量的差异从而产生了对密码子的偏爱性。大肠杆菌含有以下8种稀有密码子:AGA/ AGG /CGG /CGA/AUA/CUA/GGA/CCC。如果基因是野生型的,最好先对其进行稀有密码子分析,如果密码子稀有程度不高,可以使用Rosetta菌株用于表达这些含稀有密码子基因的目的蛋白;如果密码子稀有程度过高,最佳处理方式是经过密码子优化后直接进行基因合成。密码子优化是根据大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化筛选,一般选择使用频率大于20%的密码子。经过优化的基因序列能提高mRNA二级结构的稳定性,避免因为不充足的tRNA库导致翻译延迟,成熟前翻译终止,翻译移码和氨基酸错配。


3 选择合适的表达载体

有了优化的基因,要得到可溶性表达的蛋白,还得插入合适的表达载体。AtaGenix具有的pET28系列有广泛的适用性,而pET22b可以将目的蛋白分泌到周质空间以利于二硫键的形成和蛋白质正确折叠,从而促进目的蛋白的可溶性和活性。pGEX4T、 pET32和pET43.1 等融合系统可以通过融合蛋白起到促溶作用,增加目的蛋白的可溶性。另外pCold及pBAD系列载体也是不错的选择。


4 选择合适的表达菌株

构建了合适的载体,还得转入恰当的表达菌株进行表达。进行常规蛋白表达一般用菌株BL21;而T7E可以增强蛋白的表达; Origami则可以促进菌株胞质中二硫键的形成; Arctic可在12℃进行诱导表达改善蛋白的可溶性及活性。


5 优化表达条件

要想表达得到可溶性蛋白,除了对以上四个环节进行控制以外,还需要进行综合考虑。通过对表达系统进行优化,比如表达载体与表达菌株相容性测试和诱导表达条件的优化(包括培养基的选择、诱导温度的调整和诱导剂浓度的调整等)、可以很大程度上解决包涵体的问题。

虽然我们一直在讨论的是如何增强可溶性蛋白的表达,但也不要“谈包涵体色变”:往往包涵体表达量都非常高,而且纯化起来方便,更容易获得高纯度的蛋白样品。对于一些需要蛋白免疫动物制备WB类用途的中国亚博体育app实验来说,包涵体也是一个非常不错的选择。